食品中真菌毒素快速检测方法

　　北京维德维康生物技术有限公司（以下简称“维德维康”）是一家专注于食品中有害化合物（农兽药、微生物、重金属、非法添加物等）残留快速检测技术、动物疫病快速诊断技术研究及相关产品开发的中关村高新技术企业、国家高新技术企业、国家火炬计划重点高新技术企业和北京市专利示范单位。维德维康作为中国农业大学、国家兽药安全评价中心的产业化基地，与中国兽医药品监察所、国家食品安全风险评估中心等权威机构共建合作平台，结合自身雄厚的科研力量，形成了一系列具有自主知识产权的关键技术、重点产品和创新工艺，拥有食品安全检测抗原抗体资源近千种，供应检测试剂及设备千余种。

　　真菌毒素的危害

　　真菌毒素是由产毒真菌在适宜环境条件下产生有毒代谢的产物，广泛存在于粮油食品和饲料中，是自然发生的最危险的食品污染物之一。据联合国粮农组织估算，全球每年约有25%的农产品受到真菌毒素的污染，每年粮食及食品损失达到10亿吨。在我国，真菌毒素的污染状况同样不容乐观。根据国家粮食局不完全统计，每年真菌毒素污染造成的粮食损失累计约3100万吨，占粮食总产量的6.2%，相当于陕西、甘肃、青海、宁夏、西藏5个省（自治区）全年粮食产量的总和。

　　而粮油产品真菌毒素污染导致的应急抢救和医疗、善后抚恤、畜禽因病死亡、病畜销毁处理等间接损失更大。可以说，我国农产品中真菌毒素污染严重，已成为农业可持续发展的重要限制因素之一，严重威胁着人类与动物的健康。

　　现已查明自然界存在的真菌毒素有200多种，按真菌毒素的重要性及危害依次排列为：黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、单端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮。真菌毒素具有两种毒性，一是致DNA损伤，严重者可致癌；二是细胞毒性，有破坏质膜和细胞酶的作用。

　　对整个食品产业链而言，真菌毒素是一种“看不见的威胁”，能引起急、慢性中毒，损害肝脏、肾脏、神经组织、造血组织等，严重的可导致死亡。真菌毒素中的黄曲霉毒素和镰刀菌素被联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）列为自然发生的最危险的食品污染物，具有强毒性和致癌性。黄曲霉毒素更被列为I级致癌物，是恶性肿瘤的主要诱因之一；镰刀菌素中，以T-2毒素的毒性最强。

　　残留限量

　　目前，世界上有100多个国家或地区已经制定了食品和饲料中真菌毒素的限量标准与法规，近几年欧盟等发达国家和地区逐渐提高了真菌毒素的限量标准。我国各级政府十分重视真菌毒素的防控工作，农业部、科技部相继立项相关研究和污染调查，并分别在2005年和2011年发布和修订了真菌毒素的限量标准，在一定程度上减少了真菌毒素对人类健康的危害。几种常见霉菌毒素的残留限量。

　　主要检测方法

　　食品中真菌毒素含量的检测方法一直是制约真菌毒素与人类疾病研究进展的关键，现有的真菌毒素典型检测方法包括：高效液相色谱法、薄层色谱法、毛细管电泳法、液质联用法等。随着科技的进步，也衍生出了其他各种检测方法，如光化学衍生-高压液相色谱法、电化学衍生-高压液相色谱法、荧光光度法、液相色谱-三重串联四极杆质谱法等。这些方法所用到的设备价格昂贵，样品要经过复杂的前处理，要求技术人员有较强的操作能力和分析能力；另外仪器的耗材和维护费用都很高，导致每个样品的检测成本一般在200元以上，且仪器方法需对样本进行依次检测，而平均每个样本的检测时间均在两个小时以上，甚至需要1天的时间。新方法虽然具有灵敏、精确的优点，但普遍存在着成本昂贵、操作繁琐、人员要求高、耗费时长等问题，限制了其推广和应用，不利于常规检测，目前主要作为检测的参考依据使用。因此，建立准确、高效、快速检测真菌毒素的方法是目前亟待解决的关键问题。

　　免疫化学分析方法，是利用抗原和抗体的特异性反应为基础建立起来的特异性高、灵敏度高、成本低、对操作人员要求低的一类快速分析方法，其对环境和仪器要求低，样品检测通量高、速度快，因此适合大量样品的快速筛查和现场检测。常见的免疫化学分析方法可以分为酶联免疫吸附分析（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、免疫层析试纸条）immunochromatographic strip，ICA，也称Lateralflow colloidal goldbased immunoassay，俗称胶体金试纸条）、免疫亲和柱（Immunoaffinitychromatography，IAC）、化学发光免疫分析

　　（chemilum inescent enzyme-linked immunosorbent assay，CL-ELISA）以及时间分辨荧光免疫分析（timed-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）等。其中最常用、最成熟、应用最广的主要是ELISA和胶体金试纸条。ELISA除了肉眼定性判断和半定量判断结果，还可通过酶标仪测定吸光值进行定量分析；胶体金试纸条只需将试纸条插入待测液体，即可在几分钟内读取结果，是最适合现场检测的免疫分析方法。

　　维德维康真菌毒素检测解决方案以黄曲霉毒素M1为例介绍维德维康食品中真菌毒素解决方案：

　　黄曲霉毒素M1酶联免疫试剂盒将抗原固定到酶标板上，并保持其免疫活性。抗体与酶连接成酶标抗体，这种酶标抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。测定时，把受检标本和酶标抗体按不同的步骤与酶标板表面的抗原反应。用洗涤的方法使酶标板上形成的抗原-抗体复合物与其他物质分开，最后结合在酶标板上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅来判断样品中黄曲霉毒素M1的含量。含量少，显色深；含量多，则显色浅。

　　设备：酶标仪（检测波长450nm，参考波长630nm）；漩涡振荡器；微量移液器；计时器；离心机（4000g）。

　　检测步骤：

　　a.将样品用去离子水稀释；

　　b.将标准品工作液加入对应的标准品板孔中；

　　c.在样品孔中依次加入样品和酶标记物工作液；

　　d.盖好盖板膜，轻轻振荡，室温下避光反应；

　　e.倒掉板孔中液体，在每孔加入洗涤工作液，充分洗涤4次；

　　f.倒掉板孔中液体，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干；

　　g.立即在每孔中加入底物混合液，盖好盖板膜，轻轻振荡混匀，室温下避光反应；

　　h.揭开盖板膜，在每孔中加入终止液，轻轻振荡混匀；

　　i.终止后5min内用酶标仪取吸光度值。

　　该试剂盒灵敏度0.04ppb，原奶样本检测限为0.1ppb，奶粉检测限为0.5ppb，样品回收率范围90%±30%。

　　黄曲霉毒素M1快速检测试纸条

　　试纸条将特异性的抗原以条带状固定在膜上，金标抗体吸附在微孔中，待检样本溶解微孔的金标抗体后通过毛细作用向前移动至固定抗原区域时，待检物与金标抗体的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。

　　设备：温育器；微量移液器。

　　检测步骤：

　　a.将待检奶样和产品组分恢复至室温；

　　b.打开铝箔袋，取所需量金标微孔和试纸条；

　　c.待检奶样充分摇匀后加入金标微孔中，置于50℃温育器中温育；

　　d.将试纸条插入金标微孔中反应；

　　e.从金标微孔中取出试纸条，去试纸条下端的样品垫，判定结果。

　　结果判定：

　　阴性：T线比C线颜色深或者一致，检测结果为阴性。

　　阳性：T线比C线颜色浅或者没有颜色，检测结果为阳性。

　　无效：C线不显色，无论T线是否显色，该试纸条均判为无效。

　　该试纸条对原奶和奶粉检测限均为0.2ppb。

　　黄曲霉毒素M1胶体金检测试纸条具有灵敏度高、特异性强、快速、简便、经济、稳定性好等优点。可以满足大量试样筛选的需要，可以在小型和现场实验室进行，在商检、卫检等基层容易普及。

　　北京维德维康生物技术有限公司 供稿

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