3D 打印的发展前沿——类脑组织打印

前言

脑科学是当今科学研究重要发

展方向之一，是世界各国间科学竞争的制高点之一。2005年，瑞士洛桑理工学院的科学家亨利·马卡兰提提出通过制造大脑治疗阿尔茨海默氏症和帕金森氏症。2013年4月2日，美国总统奥巴马以获得人脑工作机理、人脑活动全图以及对无法治愈脑的疾病治疗新方法为目的，宣布启动脑科学计划。哥伦比亚大学教授与卡维理脑科学研究所联合所长拉斐尔·尤斯特指出该计划对科学的进步与经济的增长有很大的潜力。随后欧盟国家、日本随即予以响应，分别启动欧洲脑计划以及日本脑计划。欧盟委员会宣布将“人脑工程”列入到目前世界最先进的脑科学大型研究计划的“未来新兴技术旗舰计划”。日本大脑研究计划主要是通过对狨猴脑进行研究来实现对人脑疾病的探索和研究。我国已将“脑科学与类脑研究”列入“十三五”规划，在100个重大项目中排列第四位。由此可见，脑科学研究已被列入世界科技发展重要战略方向。脑科学研究中，作为研究对象的脑组织供体缺乏成为制约脑科学研究发展的瓶颈问题，而供体充足的动物脑组织不可能完全表征人脑组织特征。因此，在脑的病理模型和脑神经药物模型方面有很大的市场需求。而建立体外类脑组 织构建方法与装备是用以支持前沿重点脑科学研究发展的必要途径。

大脑具有复杂的宏观和微观结构，其结构直接影响脑的功能。在宏观结构上，脑分左右两个半球，大脑皮质大的球半脑大个每着盖覆﴿质灰﴾部分。大脑皮层的内部组织是由神经纤维或髓鞘构成的白质，外部表面是大量深浅不等的褶皱状沟回结构，使大脑皮质表面积大为增加（约2200c㎡）。在微观结构上，大脑皮质是一个高度褶叠的神经组织板。大脑皮质平均厚约 2~3 mm，是神经细胞聚集的部分，按照细胞排列次序、种类和大小不同，大体形成六个结构层次，每层层厚从200μm到1000μm不等，并且不同功能区域六层结构的厚度也有所不同（图1），神经细胞在垂直方向聚合形成圆柱形的细胞柱排列，构成了大脑皮层最基本的机能单位并组合成一个个“块状”的功能联合体。因此，复杂的宏微结构和组成都为体外构建类脑组织带来了极大的挑战。

1 类脑组织体外构建现状

为了更加便捷有效地实现人脑病理模型和脑神经药物模型药效的评价，迫切需要在体外构建结构与功能都符合人脑组织特征的模型。目前，人脑体外构建的研究较少，根据构建成型方式的不同，主要分为：体外培养构建、翻模构建以及3D打印构建等三种体外构建方式。

1.1 体外培养构建类脑组织

LANCASTER [1] 等利用人类多功能干细胞在体外环境下培育出了一个直径为4mm左右的类人脑组织，该结构为立体分层结构，被称为最复杂的“体外人脑”。PASCA [2] 等提出了一种操作简单且易重复的构造类脑分层结构的三维培养方法。该结构具有初步的电生理功能，简单的结构上的分层无法具备脑组织的相应功能。

1.2 翻模构建类脑组织

CHWALEK [3] 等以丝素蛋白构建的多孔支架同心圆环模仿灰质结构，中心孔注入胶原模仿白质结构，成功构建了3D神经网络结构，该结构具备正常神经组织的生物化学与电生理学特征。ODAWARE [4] 等构造了PDMS 微室，采用胶原凝胶固化的制造方法和控制胶原纤维的走向来定位神经细胞胞体和突触的生长方向，构建了简单的神经网络。

翻模法操作简单，且对外界条件要求不高，成型难度低，但是不适合复杂结构制造，无法实现不同位置不同细胞数量及密度的可控精确制造，因此不是真正意义上的结构仿生。因此，面对脑组织这种复杂宏/微结构及组成的巨大挑战，生物3D打印技术具有明显的优势。

1.3 3D打印构建类脑组织

生物3D打印技术来源于被称为“第三次工业革命标志之一”的3D打印技术，即生物组织打印技术。生物3D打印构建是采用打印的方式将混合了细胞的基质材料在体外进行逐层叠加制造，进而实现组织的体外精确制造。3D细胞打印可以实现打印细胞密度、位置等的精确控制，采用不同打印头相互配合实现组织的多细胞梯度结构。目前细胞3D打印技术已经在骨骼、血管、肌肉、肝脏、皮肤等方面有了较大的进展。但是人脑远比其他组织复杂，体外成活难度更高，因此3D打印类脑组织是生物制造及组织工程领域所面临的最具挑战的问题之一。

1.3.1 脑组织宏观结构仿生在宏观层面，类脑组织的构建主要是对皮质层表面沟回褶皱结构的精准仿生。KELLEY [5] 等使用光固化的方法对人脑模型进行3D打印，获得了人大脑模型，该模型实现了沟回褶皱等外表形貌与自然脑组织的仿生构造。TALLINEN [6] 等利用核磁共振影像与胶体打印妊娠22周的大脑白质模型，并在模型外周覆盖一层弹性胶体模拟灰质。充分利用两种胶体膨胀速率不同使表面凸起或塌陷形成类似于人脑的沟回，模仿了胎儿阶段人脑皮层褶皱的形成过程。且该模型与胎儿大脑表面的积分绝对平均曲率向量之间夹角的皮尔逊相关系数可以达到0.62~0.84 之间，即无论在形状上还是在曲率上与自然脑组织都十分相近。该方法实现了类脑组织外表 形貌的精准制造，但是没有应用到活体组织构建。

1.3.2 神经细胞的3D打印细胞

3D 打印在组织工程的应用中，细胞的成活率是最关键的指标。目前，神经细胞的打印方式 有压电喷墨式、热喷墨式、机械挤压式、光刻式等，均能保证成活率在60%以上。LORBER [7] 等首次将中枢神经系统的视网膜神经节细胞与神经胶质细胞应用在压电打印系统中打印，发现视网膜神经节细胞与神经胶质细胞成活率最高时分别可以达到64%与72%左右。LEE [8] 等采用使用雾状交联的方式打印神经元与神经胶质细胞，成 活 率 分 别可以达到78%与80%左右。LOZANO [9]等采用机械挤压式打印神经元细胞，细胞成活率达到73%左右。GURKAN [10] 等采用列式光刻打印方式，神经元的成活率可达80%以上。影响细胞成活率的重要打印工艺参数包括：剪力、材料黏度、打印头孔径大小、打印流速、支架材料的生物相容性等。因此，采用 3D细胞打印构建类脑组织首先应该保证神经细胞无损伤打印。在细胞打印过程中，打印头孔处由于挤压会产生一定的剪力，剪力的大小受材料粘度大小、打印头孔径、打印液体流速影响。材料粘度大、孔径小、液体流速高则产生剪力越大。对细胞造成损伤越大，细胞存活率越低，尤其是面向自身无增殖能力的神经元，特别是对突触的损伤将直接导致打印后的组织丧失生物活性或功能化。此外，细胞支架材料的 生物相容性也决定了打印后组织中细胞的成活率。体外构建类脑组织最大的难点在于，神经元不具备增殖能力。即使打印的细胞存活率较高，后期培养中细胞的数量也不会增加。针对这一问题，HSIEH [11]等选择了神经干细胞，将神经干细胞混入温敏可降解聚氨酯水凝胶，使用自己改进的熔融沉积成型 desuF﴾deposition modeling, FDM台作工﴿与气动式挤压注射系统打印了的细胞支架结构，试验结果表明采用有适当化学性质与模量聚氨酯水凝胶作为支架材料，神经干细胞可以有很好的分化与增值。该方法虽然解决了细胞增殖问题，但神经干细胞的定向诱导也是目前组织工程领域的另一个难题。

1.3.3 支架的3D打印

在3D生物打印中单纯的细胞打印并不能够形成真正的组织结构。GURKAN [10] 等采用了一种简单、低成本的阵列式光刻打印方式，将神经细胞与凝胶通过光刻的方式做成微米级的阵列，层层堆叠制造出复杂的分层结构，以此模拟脑组织的细胞与外基质结构。该方式虽然简单，不必使用高精密的机械手臂，但是与通常三维工作台控制的打印方式相比，支架并非灵活可控，导致无法实现细胞分布的精确定位控制。XU [12] 等采用热喷墨细胞打印技术将胚胎海马与皮质神经元和纤维蛋白凝胶逐层堆叠生成组织块。采用了胰蛋白酶使神经细胞暂时失去其结构，以减小剪力对细胞的损伤程度。并对打印后的细胞表型及电生理特征进行了评估，主要关注了高温喷嘴打印后的原代神经元是否会失去神经细胞的表型或生成神经胶质、肿瘤细胞等其他细胞。评估后发现打印的胚胎海马与皮质神经元重新长出了两个轴突和树枝状突起，且有正常的电生理学特性。这说明打印后的细胞正常发育。

对于复合细胞支架的打印，能够保证细胞的存活率的前提下，成型精度及多层的堆叠是面临的另一个重要的问题，即成型工艺问题。LEE [8]等利用胎鼠星形胶质细胞和神经复合胶原基质，构造了包含原代神经元与星形胶质细胞的多层胶原结构。实验以鼠尾I型胶原作为支架材料，以碳酸氢钠溶液作为交联溶液，使用逐层喷雾、逐层打印的方式完成细胞支架的打印。碳酸氢钠溶液是分配胶原前体交联的重要溶液，此种交联方式不会干扰所打印的液滴表面张力而影响打印的形貌。结果表明使用浓度为1.12 mg/mL的胶原前体作为支架材料可以维持神经突触良好的生长状态和完整的形态，为复合神经细胞支架的打印提供了重要理论依据。

以上打印方法仅仅实现了简单的神经元、神经胶质细胞混合打印，没有针对脑皮质的多层组织结构方面来设计和构建神经网络结构进行面向功能的类脑组织体外构建。然而，若要构建能够在生理和药理方面替代脑组织的体外类脑组织，精准的三维宏微结构仿生必不可少。

基于脑皮质结构的复杂组成特征，目前的研究基本都停留在神经元及结构简单的支架构建上，而复杂体外构建多层类脑组织的研究还处于起步阶段。对此，澳大利亚墨尔本大学神经工程中心的 LOZANO[9]等选择了由肽修饰的结冷胶‐天冬氨酸采，料材架支为作﴿DGR‐mug nalleg﴾用手持式喷头挤压的方法打印了三层类脑皮质结构，其中顶层及底层为包被细胞层，中间层无细胞。经过验证采用的由肽修饰的结冷胶‐天冬氨酸对神经细胞的活力具有一定的促进作用。所获得的类脑组织结构接近脑皮层的分层结构，并且能够检测到微弱的神经元电生理信号，该结构已经初步实现神经元细胞的生长及神经网络的初始化，在体外存活时间30d后未能实现组织功能化。因此，体外构建的类脑组织过程中，能否迅速有效的形成脉络丛来保证营养成分的充分传输和供应及能否给神经细胞提供充足的生长空间，都对所构建组织的体外生存、增殖能力和功能的构建起到决定作用。

2 3D打印类脑组织的难点

2.1 细胞来源

目 前 ， 类脑组织打印的细胞来源主要分为两类：即原代神经细胞与神经干细胞。其中，原代神经细胞和神经干细胞主要源于胎鼠或幼年鼠脑组织的体外培养。原代神经元比较稳定，却面临不增殖的问题。神经干细胞可以增殖，但是需要诱导分化后才可以使用。诱导分化的过程是一个极为复杂的过程，需要添加脑源性神经营养因子 cihportoruen devired niarB﴾factor, BDNF子因养营经神状睫，﴿，﴿FTNC ,rotcaf cihportoruen yrailic﴾神经生长因子 ,rotcaf htworg evreN﴾NGF gnimrofsnarT﴾子因长生化转，﴿growth factor, TGF子因长生种多等﴿进行诱导。由于生长因子加入的时间与比例需要大量试验的摸索，而且加入生长因子也很难实现完全的定向分化，导致诱导的结果并不完全是所期待的细胞类型，进而影响试验结果。

2.2 对支架材料性能要求高

类脑组织的支架材料主要负责为神经细胞提供良好生存环境，需要提供支撑和营养支持作用。对神经细胞的粘附、存活与分化起到重要的辅助作用。类脑组织支架材料需要具有较好的神经细胞相容性、较好的成形性能来维持细胞的形态与表型。支架材料的性质决定着神经细胞存活、功能化的实现及细胞打印精度。

神经细胞的支架材料主要包括胶原蛋白、结冷胶、聚氨酯、丝素蛋白等。其中胶原蛋白适合神经细胞存活，能够促进神经细胞的分化及表型的保持，但是成型较慢，打印精度及成型精度低。丝素蛋白的多孔网状结构具有较高的孔隙率适合神经细胞突起的伸展，但成型方式较复杂，不适合打印。聚氨酯成型性能适合多层打印，但是为保证神经细胞的存活率，对其化学性质及物理模量的调节要求都较高。结冷胶可以实现多层打印，且适于神经细胞生长，不过需要在使用前预先进行材料修饰。虽然可以作为神经细胞支架的材料种类很多，但是各自都有其弊端，因此完全适合类脑组织构建的神经元细胞打印条件的支架材料的研究仍处于发展阶段。因此对可打印支架材料的改性及细胞复合技术的发展以获得更好的生物相容性与机械性能的支架材料是该领域仍待解决的难点之一。

2.3 构建组织功能趋化缓慢

在完成组织结构打印的基础上，能否为打印组织提供类颅内生理环境是组织的存活和功能趋化的关键。多数3D打印组织都采用生物反应器的方式进行后期的培养和功能趋化的诱导。常见的生物反应器，是通过液体冲击的方式，增加培养液与细胞支架的接触来提高细胞的生存能力。悬浮式生物反应器通过搅动悬浮有细胞支架的培养液，通过对搅拌速度参数的优化试验发现，60r/min的搅拌速度比较适合胚胎干细胞的增殖与诱导分化。旋转式细胞培养系统和微流体灌流反应器，提高神经细胞的营养供给，增强细胞的分化程度，可以减少体外培养的神经组织因尺寸过大和细胞密度过高而带来的细胞坏死现象。

功能诱导主要有力学、电磁学、声波等几种方式。力学刺激，也是改善神经细胞生存条件的有效方式之一。如，微型拉伸生物反应器，通过以1μm/min的速率拉伸贴合在基板上的背部神经，使神经突触沿拉伸方向生长，同时促进干细胞分化和神经细胞成熟。电磁效应对大脑皮层也有一定的影响，试验表明，正极刺激使运动电位振幅增加，负极电位使运动电位降低，并且直流电刺 ﴿Am 2～1﴾激大脑皮层可以提高脑左侧后顶叶皮层计算相关功能水平。声波对脑神经系统也有着一定刺激影响，通过对前额叶皮层进行经颅噪声刺激，使用近红外光谱测量血流动力学反应来检验效果，发现100～600 Hz声波有增强脑功能的作用。可见，力学、电磁学、声波等方式对改善脑神经细胞的生存、脑神经系统及大脑皮层功能等某个方面有一定的作用。自然脑组织所处的复杂生理环境决定了单独的诱导方式无法满足类脑组织功能的分化的需求，因此需要多种诱导方式联合使用，针对不同功能区域的诱导需求，通过一系列试验研究来确定各种诱导因素的最佳组合方式、施加频率及时间等，最终实现类脑组织功能趋化。由于影响因素相互间错综复杂的关联，致使功能诱导成为类脑组织培养的又一大难题。

2.4 培养环境需求特殊

与其他活性组织类似，体外构建的类脑组织需要特定的培养环境来保证组织生长和功能趋化——类脑生物反应器。相比其他活性组织，类脑组织内细胞的行为、氧等的营养代谢等状态对环境因素的敏感性更高。文献中发现的对类脑组织有显著影响的环境因素主要包括氧气浓度、pH值、培养液成分、温度、湿度、电磁场等。

目前体外组织培养主要是在常氧环境体个年成但，的行进下﴿%02﴾脑内神经干细胞所处的微环境中氧浓度在3%～6%。研究表明，5%氧气可促进新生大鼠中脑神经干细胞的增殖。由此可以推论适度低氧环境可能有利于神经细胞生长。培养环境中pH值的变化也会影响细胞状态，pH值过低会导致神经细胞酸中毒，造成神经元损伤。研究表明，培养时的高湿度和体积分数为0.07的CO 2 空气的外环境以及pH值保持在7.2～7.4之间的培养液均有利于神经细胞的生长。综上所述，为保证神经细胞在支架中的良好状态，满足神经细胞生长需求，准确调整培养环境中各因素参数尤为重要。

3 体外构建类脑组织策略——打印培养一体化

3D 打印及体外培养是类脑组织体外构建中最关键的两个方面。传统的生物组织打印方式，打印与培养是两个独立的过程，组织打印后被转移到相应的培养环境中。此方法的弊端在于打印过程中无法保证周围环境达到组织培养环境需求，会降低细胞的打印质量和成活率。神经细胞对供氧、温度、湿度及无菌等外界条件要求很高，一旦脱离其原有的培养环境，很容易死亡或凋亡。同理，打印构建的类脑组织——神经细胞和基质材料复合体，有很高的生理环境需求。因此将打印和培养过程统一在相同的环境下可以促进类脑组织后期的细胞成活与生长。打印和培养过程一体化的方式，即将打印工作台放置于培养环境中使得打印环境满足培养条件，省去了打印后的转移操作。但是，有限的培养空间及较高的培养温、湿度要求，会提高对工作台构件材料、设计尺寸以及运动行程的要求。材料的防腐、丝杠轴承的润滑会对环境造成污染。即使找到了可以适应相应环境的材料，其机械性、使用寿命、加工难易程度、材料成本及无毒性等难以同时满足设备的精度和环境要求。

因此，本文提出将采用一种超净高稳定性类脑组织3D打印培养一体化的系统，如图2所示。该系统主要有三维移动工作台及培养系统两部分相互配合组成（图 3）。其中，移动工作台运动速度范围是0～50 mm/s，xyz 三轴行程都设定为150 mm，且在此运动速度范围与行程的大小的条件下满足10 μm的定位精度，无振动、爬行等干扰现象，喷头的流量范围控制在 0.14 μL/min～52.95 mL/min。培养系统参数设置为：温度37℃，湿度65%，CO 2 浓度 5%。以满足类脑组织打印培养参数要求。

该系统在打印过程中不受实验室环境及打印设备本身的影响，避免了3D打印工作台处于较高的温、湿度环境中，减小了对工作台构件材料的工作环境及操作要求，提高了工作台的使用性能和寿命，降低了制造成本。同时更好的满足类脑组织打印及培养环境。

4 结论及展望

4.1 结论

类脑组织的体外构建是脑科学计划的重要基础，3D生物打印技术在复杂细胞结构组织的体外构建中具有明显的优势，可以实现组织个性化需求，包括细胞种类、密度、基质种类、结构等方面的精确制造，为体外构建功能化的类脑组织等提供了精准可靠的仿生制造手段，为未来脑的病理模型和脑神经药物模型的应用奠定试验材料基础。目前采用3D细胞打印方法构建体外类脑组织存在：细胞来源匮乏、适合打印的支架材料不足、功能诱导方式复杂和组织培养环境需求高等难题。本文最后提出的打印培养一体化系统，减少打印后组织向培养中转移的过程，有望提高组织的生物活性和功能趋化性能。

4.2 展望

3D细胞打印技术在类脑组织体外构建中广泛的应用，实现近似脑组织结构特征的多细胞定向分布打印，所提供的个性化组织模型在未来脑科学发展中具有相当的意义和价值。例如通过三维自然脑组织结构中对神经元进行精准定向的控制和调节来实现对记忆的控制和编辑；或通过定向强化记忆神经功能区域来实现高难度技能的有效培训，进而对恐惧等神经行为进行干预和控制等。