丙型肝炎临床检验技术现状及研究进展

　　【摘要】 丙型肝炎是一种严重的传染性疾病，属于全球公共卫生问题，丙型肝炎病毒（HCV）感染是造成该疾病的主要原因。丙型肝炎的传播途径较多，包括血液、母婴传播、性传播和家庭生活密切传播，但是大部分的传播途径并不能够完全明确。目前，丙型肝炎已经全球化，且对于人类健康构成了严重威胁。目前，临床检验技术发展较为迅速，在丙型肝炎的诊疗中，实验室检验具有重要作用。目前，丙型肝炎的检测方式较多，何种方式更具有检验价值，目前尚未完全明确。研究对于丙型肝炎的流行结构、基因组织结构、检验技术等情况进行了总结，并展开以下综述。

　　丙型肝炎为常见传染性疾病，丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是造成该疾病的主要病毒，可引起肝损害，主要是经血液进行传播的一种全身性感染疾病。此外，该疾病的传播途径还有家庭内接触、母婴、性等方式，但是很多的传播途径并不是很明确，因而该疾病传播存在隐匿性和综合性。有关数据显示，目前全球患有丙型肝炎的人数为1.85亿，感染率达到了3.1%[1]。每年该疾病的新发病例数为300~400万，中国占比为3.2%，显著高于世界水平，因而是感染丙型肝炎最多的国家。相关数据显示，在丙型肝炎中，约有70%可发展至慢性病丙型肝炎，20%可发展为肝细胞癌、慢性肝病、肝硬化等。目前，临床尚无预防丙型肝炎的疫苗，因此寻求一种有效的途径进行检验，对预防和治疗该疾病具有重要意义。对早发现和早治疗具有重要的意义，可有效避免疾病进展，影响人类健康。

　　1 HCV基因组结构与特点

　　在黄病毒科丙型肝炎病毒中，HCV属于单股正链RNAS病毒，该病毒长度是9.6kb，27kb的非编码区和341bp的非编码区是该病毒的主要基本组成，编码的种类有3000种。受多重因素影响，可裂解为非结构蛋白质和3种结构蛋白质，对于病毒的编码、复制以及合成具有重要作用。HCV具有高度的异质性，其中E1与E2区域具有可变性，5’UTR和3’UTR的末端区具有高度的保守性。有关数据统计发现，在慢性病感染患者中，每天产生的病毒颗粒数量有1012个，由于HCV具有较高的复制率和易错率，因此病毒聚合酶活性结合时能够出现遗传多样性。

　　2 丙型肝炎流行情况

　　丙型肝炎感染存在隐匿性，其中约有10%的患者可发展成为肝硬化或者肝癌，因此早发现、早治疗该疾病对改善预后具有重要作用。WHO显示，丙型肝炎的流行率是3.1%,每年死亡人数有35万～50万人[2]。国内丙型肝炎报告数据显示该疾病的发生率不断升高，发生地区主要为华中、华北、东北、西北，其中感染率最高的是西北，感染率最低的是华东。

　　3 丙型肝炎检测技术分析

　　3.1 抗HCV检测

　　抗HCV检测为早期检测丙型肝炎的一种技术，病患外周血液中的病毒含量较低，因而常规检测方法可失效。经研究发现，抗HCV技术直接实现了酶联免疫吸附法的应用，抗HCV检测的发展已经有3代，第1代为抗HCVIgG试剂盒的应用，抗原可对病毒基因的非机构区实施监测，感染率较低，可降低80%。第2代的基础是C100抗原，通过添加HCV核心区多肽C22-3等，可显著促进-C22染色显示，进而提升特异性、敏感度。第3代的HCV抗体以酶联免疫吸附法实际为基础，对于NSS多肽进行重组，核心区的抗原会降低，非结构区的抗原比可发生降低，敏感性、特异性可提高。

　　3.2 HCV-RNA核酸扩增检测技术

　　在外周血的监测中，HCV-RNA是一种重要的客观指标，可有效反应出复制活跃性。在发生感染的2个星期后，血清中可以检测出HCV-RNA，在自然恢复期，HCV-RNA的水平会达到最高状态。目前，HCV-RNA核酸扩增检测技术属于重要技术，可有效确认HCV感染，但是该种方式的假阳性结果较高，进而对于工作试验推广造成影响，因而该种技术对于其他技术存在一定的限制[3]。HCV-RNA核酸扩增检测技术在进行检测时，全部检测项目和过程均需要严格保证交由经验丰富的检验人员，进而保证检测结果的准确性，此种检验方式的过程较为繁琐，可行性较低，此外，在实施检查，受意外情况影响，还可降低检查的准确度，因此普及较为困难。

　　3.3 HCV抗原检测

　　对于HCV抗原的临床研究，主要内容是非结构抗原与核心抗原，均为检测HCV感染的重要项目。在血清中，对于HCV抗原进行检测，能够及时发现早期病变患者，尤其是针对功能降低或者是免疫功能紊乱的病患，存在各型抗体附着情况，核心抗原难以进行有效检测，且难以开展前期治疗。

　　4 丙型肝炎检测方法与原理

　　丙型肝炎的检测方式较多，包括化学发光试验、胶体金快速试验、免疫印迹试验、HCV-RNA检测试验、酶联免疫吸附试验等。主要诊断方法为HCV抗体检测与HCV-RNA检测，酶联免疫吸附试验化学发光微粒子免疫法（CMIA）是HCV抗体检测的主要方式，HCV-RNA检测主要是PER-荧光探针法检测。

　　4.1 化学发光试验

　　化学发光微粒子免疫分析能够结合高度灵敏的化学发光测定技术以及高特异性免疫反应技术，主要用于激素、各类抗原、半抗原、脂肪酸、抗体、酶、维生素、药物等检测中。化学发光微粒子免疫分析法的检验原理主要为HCV免疫测定，可测定人血清和血浆中HCV抗体，可与化学发光微粒子免疫分析检测技术结合，进而检测HCV[4]。在具体检测时，首先对于样本中HCV重组原包被顺磁微粒子与项目稀释液进行融合，冲洗后再加入吖啶酯标记结合物，再次进行冲洗后加入激发液以及预激发液，通过反应中发光信号的化学反应测量HCV抗体含量，进而获取HCV抗体含量。样品中，HCV抗体含量和雅培全自动化学发光免疫分析系统检测出的RLUs值呈正比，化学发光微粒子免疫分析法具有检验快速、操作简单、不需要催化剂等优点，对小分子实施检测时，采取竞争法，对大分子抗原实施检测时采取夹心法，非特异性的结合较少，本底较低，与大分子相结合后并不会缩减光亮，反而会增加灵敏度。

　　化学发光法存在无反射性、高灵敏度与高特异性特点，但是该种检测方式极易出现假阳性率。造成假阳性结果的原因可能与存在其他抗体干扰，例如标本状态、类风湿抗体、溶血、标本乳糜、纤维蛋白原等[5]。为避免假阳性结果，应对检验人员进行严格的要求，保证操作更为规范，同时还应注意对结果进行综合性判断。

　　4.2 胶体金法快速试验

　　胶体金法快速试验主要是免疫层析试验、免疫渗滤试验。免疫渗滤试验检测时，原理主要为斑点免疫胶体金快速试验，试验载体是硝酸纤维薄膜，HCV抗原能够在膜上点状固定，通过加入待测样品后若结果为阳性，则膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间一般在10min以内，有效试验质控点应显色[6]。

　　胶体金法快速试验同样共有阴性情况，导致阴性的主要原因可能是气温低、反应不充分、加血量过少或者过多、判断结果时间较短等。若过滤膜存在破损，血液可渗出滤膜，影响检测线，进而造成检验结果差错。若缺乏判断经验，极易将隐约阳性线判断为阴性，将弱阳性判断为阴性，造成假阴性结果。

　　4.3 荧光定量PCR法

　　荧光定量PCR法是病毒核酸检测的常用检测技术，能够直接实施检测，检测灵敏度较高，将该种检测技术应用于丙型肝炎诊断中，可有效检出HCV RNA，即使病毒量较低，同样可检出阳性。荧光定量PCR法的原理主要是将HCV基因编码区、高度保守区作为靶区域，涉及荧光探针和特异性的引物，实施RT-PCR扩增后，可定量检测血浆或者血清样本中的HCV-RNA。HCV-RNA病毒量的多少或者阳性主要证明是否存在病毒，同时可反映出病毒复制情况和传染性强弱。动态观察HCV-RNA、抗HCA变化，可判断丙型肝炎的用药、疗效及预后，同时还可提供客观评价指标[7]。相较于高敏化学法，荧光定量PCR法同样存在假阳性，但是假阳性率低于高敏化学法。

　　4.4 酶联免疫吸附法

　　酶联免疫吸附法是一种常用的HCV筛查方式，该种技术的主要检测原理是将HCV抗原包被固体定为载体，义辣根过氧化物酶反应抗人IgG和检测样品后通过邻苯二胺底物显色，最后采取酶标仪分析阳性检测结果。该检测过程的主要反应情况为：在已包被抗原反应加入待测样本，置于反应中进行孵育，一旦标本中存在HCV，可与微孔中的抗原形成固相抗原抗体复合物，因免疫球蛋白与样品的杂质无法结合固相抗原，进行冲洗时可被洗去；加入酶结合物后在孵育过程中，酶结合物与抗原抗体复合物结合并洗涤后，可在TMB底物反应后显色，加入终止液后通过酶标仪分析测量结果[8]。

　　造成酶联免疫吸附法假阳性的主要原因是：①试剂原因。试剂的提纯度不够，包括抗原、酶结合物纯度低、多克隆抗体等纯度不够，主要与厂家存在关系，是解决的重要项目之一。②患者原因。患者血液中存在高免疫蛋白、超氧化物歧化酶等。③检验者原因。检验人员在进行检测的过程中操作不规范，洗板针存在堵塞、注液量缺少、抽吸不全等情况，均可造成结果假阳性[9]。

　　5 结语

　　总而言之，随着医学技术的发展，临床对于丙型肝炎的检测技术同样在进步，无论何种检验方式，均离不开早期准确诊断、灵敏度高、检测速度快等原则。HCV抗体检测的临床应用较为广泛，且检测的灵敏度较高，检测窗口期不断缩小，可直接进行检查。HCV-RNA检测技术较为成熟，但是需要具备严格的实验室条件，因而难以在基层医院开展。在实际检测过程中，可根据病患实际情况采取有效的临床检测技术，进而切断传播途径，控制疾病感染。

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