以细菌细胞壁为靶点的抗菌药物进展分析

　　【摘要】 最近几年，细菌耐药率不断提高，需要对全新抗菌药物的研发充分重视。细胞壁为植物细胞、细菌所特有的一种结构，人体及动物细胞中并不存在，以细胞壁为靶点的抗菌药物存在低毒性以及高选择性等特征，当前越来越成为研究抗菌药物靶点的重要内容。

　　细胞壁是位于细菌细胞内膜之外的弹性结构，其包含了多种成分如表面相关物质、脂多糖、脂磷壁酸等，细胞壁保护细菌细胞、维持细胞中渗透压效果明显，能够对细胞形状起到决定性作用。除古细菌细胞壁如产甲烷细菌之外，在各细菌细胞壁中均存在肽聚糖。当前，人们逐渐对此进行了充分重视和关注，并取得了一定进展。

　　1 肽聚糖生物合成

　　在细菌细胞壁中，肽聚糖的作用极为显著，肽、聚糖两部分则可组成肽聚糖单体，肽主要分为肽桥、四肽尾，肽桥是连接四肽尾分子的短肽链，其变化相对复杂[1]。对于肽聚糖单体分子，其交织后会形成网套结构，这一结构具有一定的机械性和严密性。

　　虽然肽聚糖骨架存在一定的相似性，但是对于不同类型的细菌细胞壁来说，其也具有显著差异性，如四肽尾氨基酸交联、组成方式等有着明显区别。不仅如此，细菌细胞形态会受到肽聚糖干扰，再加上其合成过程复杂繁琐，肽聚糖前体在细胞质中合成后会跨越细胞膜进行转运，根据合成部位之间的差异可以分成不同阶段如细胞膜、细胞质以及细胞外等。

　　2 细菌细胞壁抑制剂筛选手段

　　2.1 全细胞筛选

　　最初的全细胞筛选方法主要包括L型筛选及原生质体筛选。有学者发现，在对原生质体所进行的筛选中，青霉素不但能够对革兰阴性菌形成失去细胞壁的原生质体进行有效抑制，对于普通细菌生长的抑制效果也极为显著，但与此同时，对原生质体生长不存在抑制的化合物，则确定其可以对细胞壁进行有效抑制。此外，其还可以在一定程度上筛选细胞壁合成路径，应用价值较高，如青霉素、磷霉素、衣霉素、黄霉素、硫霉素以及头孢菌素等。通过深入探析研究青霉素后可知，特定状态下取得的无细胞壁细菌在青霉素研究中可以发现，在一定条件下，所获取到的无细胞壁细菌能够对通路抑制剂进行筛选。但是就大部分细菌而言，一旦细胞壁丧失，渗透压敏感性则也会受到影响，所以很容易造成其死亡，有着较高的死亡率，但是L型对于大部分细胞壁抑制剂并不存在敏感性。有学者表示，通过L型细菌所创建出的L型筛选方法能够对抑制野生型细菌生长的筛选起到促进作用，整体效果极为明显，但其也存在无法对缺乏细胞壁的L型细菌生长化合物起到抑制作用等问题和不足，这也就进一步证明了化合物对细胞壁合成路径所产生的作用[2]。L型筛选可以在一定程度上对抑制细胞壁合成过程中的各步骤抑制剂进行有效筛选，临床中雷莫拉宁、替考拉宁则主要是凭借这一筛选方式所取得。通过这些方式所筛选出的细胞壁生物合成抑制剂其活性浓度主要是集中于最低抑菌浓度，这也就进一步证实实验灵敏度具有有限性。若所给定的化合物存在其他活性，则这种活性会逐渐对细胞壁特异性活性进行抵消，为初级筛选，并且受到细胞膜的直接影响，可以更为直接、有效、及时地筛选抑制细胞壁合成后期化合物，效果极为明显。

　　相关研究显示，对于结合基因调控表达和反义RNA技术而言，其可以对条件生长菌的创建能够起到推动和促进作用，即其自己并不能产生生长所需化合物，为了能够使细菌正常生长获得确保，需要进行人为添加。该技术主要是凭借对细胞壁合成抑制剂所进行的筛选作用使该目标基因mRNA表达水平下降，从而使目标基因合成蛋白量下降。通过下调基因，该基因表达蛋白所参与的生物合成过程对靶向该基因化合物的敏感性也会随之受到严重影响，所以有必要将其应用于全细胞药物筛选，能够取得显著成效，值得大力推广支持。

　　2.2 体外筛选

　　体外生物化学筛选的主要特征为便捷性、直观性，将候选化合物加入到该体系，能够对产物生成抑制情况进行准确、直观观察，同时还可以依照关键酶底物结构在分子水平现实情况将底物类似物找出。单一就体外筛选而言，在靶分子抑制剂所进行的筛选中其作用和优势更为明显，特别是可以进一步对肽聚糖合成当中的胞内酶进行筛选[3]。一般情况下，在细胞膜作用下，全细胞筛选在细胞膜影响下其并不能对关键酶抑制剂进行筛选。而体外筛选的实行，纯化、表达获取可溶性蛋白难度较小，并且在酶底物商业化的干扰下，直接对这些酶产生作用的抑制剂其相关报道也越来越呈现出增加趋势。并且有关直接破碎细胞筛选及改变细胞膜通透性筛选方式均有报道。

　　创建反应体系及合成前体是对糖基化酶抑制剂进行确定的重点所在，该方法一般凭借放射性标记的青霉素和青霉素结合蛋白的转肽酶活性位点进行特异性结合，之后将待测化合物竞争结合的青霉素结合蛋白转糖基化酶活性位点及黄霉素Affi-Gel凝胶珠加入其中，凭借洗脱手段将未结合黄霉素凝胶珠青霉素结合蛋白去除后对其放射性情况进行检测，可以进一步确定待测化合物对于转糖基化酶竞争性抑制情况，应用效果极为明显[4]。体外利用类似生物化学方法对Mur通路抑制剂进行筛选的报道较多，但是当前其在临床中尚未获得有效应用。有学者在对化合物是否可以和抑制MurA抑制剂磷霉素竞争活性位点进行检测之后筛选出了几种MurA抑制剂，但是其抗菌机制和MurA并不存在显著的相关性，结构和磷霉素之间存在明显差异。

　　3 作用于细菌细胞壁合成的抗菌药物

　　3.1 第一阶段

　　3.1.1 MurA抑制剂 MurA抑制剂为广谱抗生素磷霉素靶点，磷霉素在小儿胃肠道感染、尿路感染的治疗中有着较为普遍的应用，其一般凭借和活性中心Cyc115烷基化成为MurA的不可逆抑制剂[5]。在细菌中，对于Mur蛋白基因因为其高度保守性特征极为明显，因此和这一靶点有关的各项研究、报道也随之增加，而筛选酶方式的不断进步，一些化合物也被发现。

　　3.1.2 MurB抑制剂 MurB对于催化细胞壁合成细胞有着极为关键的作用，但是其MurB参与反应产物为MurA的强反馈抑制剂，加入MurB抑制剂能够MurA反馈抑制进行削弱，MurA在催化大量产物后会不但会和MurB抑制剂竞争MurB活性中心，还在一定程度上对MurB抑制剂效力产生影响。相关研究表示，吡唑烷类似物能够对其反应进行抑制，但是当前并没有化合物可以在机体内明确靶向MurB[6]。

　　3.1.3 MurC-F抑制剂 MurC、MurD、MurE和MurF为均为氨基酸连接酶，其分布并存在于肽聚糖合成途径，受到催化作用后形成五肽尾。以上氨基酸连接酶其功能、结构都存在相似性特征，所以一直表现有着共同之处。次磷酸盐是一种氨基酸连接酶抑制剂，但是大部分并不存在抑菌活性。

　　3.1.4 D-Ala支路阻断剂丙氨酸 消旋酶(Alr)和D-Ala连接酶(Ddl)在D-Ala支路中的作用极为关键，与此同时还是非常重要的抗菌靶位。在这一支路，用于结核分枝杆菌的环丝氨酸是一种有效性较高的抑制剂，能够对该通路的Alr和Ddl起到抑制作用。酶的不可逆性失活主要是和黄丝氨酸在和辅酶PLP活性位点共价相结合有关，会对Alr造成抑制；而对于Ddl而言，其主要借助和D-Ala对底物结合位点的竞争从而使其抑制效果获得充分展现。研究发现，肽聚糖末端二肽作为一种ALr抑制剂，肽在对其转运之后则会逐渐被吸收，其活性和细胞中代谢释放部分息息相关，但是其活性首先和假单胞菌、链球菌转运效率下降有关[7]。

　　3.2 第二阶段

　　3.2.1 MraY抑制剂 在细菌生长中，细菌转位酶有着极为关键的作用，这一靶点作用明显，尤其是在新型抗生素的开发中更为显著。在对MraY晶体结构及构效关系进行解析后可以明显发现，各种针对MraY的抑制剂逐渐产生。通常情况下，MraY抑制剂类型较多，其中最为常见的有脂肽类、核苷类、肽类。依照其自身特点、作用机制等可对其展开更为细致的划分。最近几年有研究发现，含有尿嘧啶结构的尿苷肽类化合物存在一定的抑制MraY作用。

　　3.2.2 MurG抑制剂 MurG为保守性转移酶，尤其是在细菌中具有高度保守性，主要负责LipidⅡ合成。尽管当前已经创建了相应的体外筛选系统，并且蛋白晶体结构获得了解析，但是有关MurG抑制剂的报道却少之又少。莫雷拉宁的抑制MurG效果明显，但是不会对酶本身产生直接性作用，主要是凭借和酶的底物LipidⅠ相结合对MurG进行抑制。并且抑制MurG小分子杂环类化合物这一途径的取得主要是一般和荧光供体取代的高通量方法对化合物库的筛选作用有关，但是值得注意的是，其亲和力较低[8]。在对过度类似物进行设计之后可以发现，其可以对大肠埃希菌MurG进行抑制，结构包括尿苷核苷、脯氨酸、α-羧酸，但不具有抗菌活性。

　　3.3 第三阶段

　　3.3.1 转糖基酶抑制剂 细菌的转糖基酶（transglycosylase，TG）为青霉素结合蛋白，其在细菌体内有着极为关键的作用。当前可以将细菌转糖激酶分为直接、间接对酶产生作用的。较为典型的对酶细菌转糖基酶抑制剂为磷酸酯类衍生物，并存在广谱性。相关研究表示，moenomycin可以有效替代二糖衍生物且抗菌活性作用明显，但是因为moenomycin体内活性普遍偏低，当前尚无用于临床的药物。间接作用主要是凭借和酶的底物相结合进而实现对TG所进行的抑制，主要包括替考拉宁、万古霉素、雷莫拉宁等糖肽类抗生素[9]。其中替考拉宁、万古霉素为临床常见药物，雷莫拉宁是一种全新的糖肽类抗生素。羊毛硫抗生素不但能够在膜上形成高度特异性孔隙，还可以对肽聚糖的合成起到抑制作用，近几年来其应用日渐广泛，并取得了明显效果，再加上其在机体中存在高抗菌活性并且安全性较高，当前在食品防腐剂中取得了一定应用。

　　3.3.2 转肽酶抑制剂 转肽酶和TG极为相似，β-内酰胺类抗生素是一种抑制剂，并且存在典型性，当前已经获得了临床广泛关注和认可。在结构上，β-内酰胺类抗生素和TP底物D-Ala-D-Ala相类似，在和底物对酶的活性位点进行竞争后对酶活性进行抑制，并且一些非β-内酰胺类化合物也可以对TG进行有效抑制，如4-喹诺酮类、硼酸盐等，其中硼酸盐被认为是和TP共价结合，并且单纯就非β-内酰胺类化合物而言，其抗菌活性和青霉素结合蛋白结合并没有关联，同时也是对该类化合物开发造成阻碍的重要因素[10]。万古霉素如糖肽类抗生素不但可以对TG进行有效抑制，同时在和底物相结合之后能够对TP进行有效抑制。就达巴万星而言，在结合于底物后可有效抑制TP，但是对于奥利万星，其一般都是在和细胞壁肽桥接区段相结合后对TP进行抑制，而在和底物相结合之后可以对TG起到抑制作用。

　　4 结束语

　　当前细菌耐药问题日渐凸显，需要及时、高效地研发出新型抗生素，最大程度地满足临床各项需求。对于多数会抗生素，其抗菌效果主要是通过细菌高度保守代谢实现，并且细菌细胞壁肽聚糖合成这一过程必不可少，对于细胞存活有着非常关键的作用，且在人类并不存在同源基因。对细菌细胞壁产生作用的抗生素其具有一定的选择性、安全性，尽管当前各学者更为深入地探索、分析了肽聚糖合成过程，但是整体进程较为缓慢，其多数抑制剂抗菌活性无法获得充分展现。这就需要改变化合物进入细胞途径并控制好化合物在细胞中的量，使其价值获得充分展现。当前，通过研析细胞壁合成中关键酶可知，细胞壁作为药物靶标其有着较为广阔的发展和应用前景，影响较大。

　　5 参考文献

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　　[2021-11-17收稿]