人工接种柑橘绿霉病病原菌的方法研究进展

　　陈真凤，唐 诗，梁嘉振，杨春敏，谢雨轩*

　　（广州工商学院 工学院，广东广州 510800）

　　摘 要：柑橘采后极易感染真菌性病害，其中柑橘绿霉病尤为显著。本文介绍了柑橘绿霉病及其致病因子和发病过程，并重点阐述了这种柑橘病原菌的人工接种方法，主要有打孔法接种、划十字伤口接种、刺伤接种、涂抹接种等，为柑橘绿霉病生物防治的研发提供理论依据和参考。

　　关键词：柑橘绿霉病；侵染机理；发病过程；人工接种法

　　柑橘是芸香科柑橘属木本植物，种类主要包括甜橙、宽皮柑橘、柚、葡萄柚、柠檬及其杂交后代等[1]。柑橘因其果肉饱满、汁水充沛，含有丰富的人体必需的营养素，具有增强身体免疫力、降低血压等功效，深受人们的喜爱。但柑橘果实采后极易被微生物侵染，导致柑橘腐败变质，其中柑橘绿霉病尤为典型。这种柑橘病害导致果实腐烂率一般在20%～30%，不但降低了柑橘的品质和营养价值，还使柑橘的货架期缩短，其造成的经济损失不容忽视。为了抑制柑橘采后绿霉病的发生，研究者们常通过人工创伤使柑橘患病的方式来探究有效防治柑橘绿霉病的有效方法。

　　目前，在柑橘绿霉病的生物防治研究中，无论是让柑橘先患病再接种活性微生物及其代谢产物以此来探究其防治效果，还是先给柑橘接种活性微生物及其代谢产物再接种病原菌来探究其预防效果，人工接种病原菌都是必不可少的一环。本文主要阐述了柑橘绿霉病的致病因子、发病过程和人工接种方法，为建立植物病害人工接种系统提供理论依据，从而促进柑橘绿霉病的生物防治，助力柑橘农业经济的发展。

　　1 柑橘绿霉病

　　柑橘绿霉病主要是由指状青霉（Penicillium digitatum）通过侵染柑橘表面伤口引起，多发于宽皮柑橘中，是贮藏期间发生最普遍的一种病害[2]。该病通常仅发生于柑橘果皮上，使病害部位的果皮凹陷皱缩[3]。

　　指状青霉的分布范围十分广泛，适宜生长温度为28～30 ℃[4]，能在各种有机质中营腐生生活，产生大量分生孢子。其分生孢子的传播方式主要是空气传播，从而潜伏在柑橘采后贮存、运输、销售等过程中，当接触到果实表面的伤口时，病原体便会被激活，使柑橘感染绿霉病，从而引起腐烂变质。

　　2 致病因子和发病过程

　　2.1 致病因子

　　2.1.1 细胞壁降解酶

　　柑橘绿霉病的病原菌侵入果实后，会产生角质酶等多种细胞壁降解酶。在角质酶的作用下，果实表皮的角质分子会被分解；其他细胞壁降解酶则会分解细胞壁中的主要成分，如果胶类物质、纤维素和半纤维素等。经过多种细胞壁降解酶类的相互配合，会使细胞壁变得松弛，同时也为病原菌提供了生长必需的营养物质[5]。

　　2.1.2 pH值

　　柑橘绿霉病的病原菌拥有pH调节系统，能使其在最优pH值下产生这些酶和其他产物[6]。例如，指状青霉在柑橘腐烂过程中，能产生有机酸来降低果实的pH值，从而增强致病性[7]。

　　2.1.3 真菌毒素

　　柑橘绿霉病的病原菌在侵染过程中能产生对果实有毒的真菌毒素，此毒素能干扰果实的正常生理功能，损伤果实组织，诱导病害的发生[8]。于新等[9]通过紫外可见光谱、红外光谱和高效液相色谱分析出柑橘绿霉病菌在侵染果实时产生了展青霉素和青霉酸。

　　2.2 发病过程

　　柑橘绿霉病的感染初期，指状青霉的分生孢子会在果实伤口处萌发，伤口周围出现水渍圈，感病部位的色泽略淡于健康果实，且会变得湿软，手指按压该部位能感受到果皮易破；2～3 d后，指状青霉的白色菌丝会从伤口中央不断向外扩展，随后伤口中心的指状青霉会长成青色或深绿色；后期柑橘果实表面的菌丝和霉层会迅速扩散到整个果实上，最后致使果实完全腐烂[10]。

　　3 人工接种法

　　接种柑橘病原菌前需对果实进行前处理。近几年果实前处理方法大多为挑选体积、颜色、成熟度相同，且表面无损伤的柑橘果实，用体积分数为2%的NaClO溶液浸泡2～3 min，随后用蒸馏水对果实冲洗2～3遍，待其表面水分自然晾干后即完成果实的前处理。少数人接种病原菌前还会用75%酒精溶液擦拭接种部位。前处理后就对果实进行柑橘病原菌人工接种，接种完伤口晾干，便可进行保藏培养，几天后计算果实的发病率、病斑直径和病情指数等指标。

　　3.1 打孔法接种

　　打孔法接种是指用无菌打孔器在果实表面打出一定深度与一定直径的小孔，往孔里加入一定量的病原菌孢子悬浮液即可[11-13]。

　　李心丹等[11]在探究抗菌肽Jelleine-I对柑橘采后绿霉病的防效时，用灭菌打孔器在丰脐赤道处等距打出2个3 mm×4 mm的伤口，向伤口内接入10 μL

　　的病原菌孢子悬浮液（1×104 CFU·mL-1），6 d后发病率约达80%，病斑直径为70 mm。何甜等[12]在探究裸脚菇0612-9的活性物质对柑橘绿霉病的防治效果时，用无菌打孔器在‘南丰’蜜桔腰部打1个2 mm×3 mm的伤口，往伤口加入20 μL指状青霉的孢子悬浮液，5 d后发病率约100%。2022年马电通等[13]在探究利用羧甲基纤维素来诱导提高罗伦隐球酵母对砂糖橘果实绿霉病的防效时，用无菌打孔器在砂糖橘赤道部位等距打3个5 mm×4 mm

　　的孔，孔中注入20 μL指状青霉孢子悬浮液。第4天，发病率约为100%；第7天，指状青霉的病斑直径为（3.07±0.07）cm。

　　3.2 划十字伤口接种

　　划十字伤口接种是指用消毒过的手术刀在柑橘果实表面划出一定大小、深度的十字伤口，在伤口处接种一定量的病原菌孢子悬浮液即可[14-15]。

　　林波等[14]在探究盐酸小檗碱抑制柑橘绿霉病的作用机理时，用小刀在‘宫川’果实赤道附近划出

　　3 mm×3 mm的伤口，往伤口处接种10 μL指状青霉孢子悬浮液（1×105个/mL），5 d后，指状青霉的病斑直径为（5.62±0.09）cm。谭元珍等[15]在探究反式-2-乙烯醛环糊精包合物对柑橘采后绿霉病的防治效果时，用无菌手术刀在椪柑赤道部位等距划出2个

　　3 mm×3 mm的十字伤口，往伤口里接种指状青霉的孢子菌悬液（1×105 CFU·mL-1），6 d后，椪柑的发病率达100%。

　　3.3 刺伤接种

　　刺伤接种是指用无菌接种针在果实表面刺出伤口，然后往伤口里加入病原菌的孢子悬浮液，也可以直接用接种针蘸取病原菌的孢子悬浮液再对果实进行刺伤。该方法操作时大部分人是用单支接种针进行接种，但也有学者是用几根接种针捆成一捆再刺伤果实接种[16-18]。

　　姜丽英等[16]在探究嘧霉胺对采后柑橘浸果处理的防效时，是用6根大头针捆成一捆，蘸取柑橘绿霉病病原菌的孢子悬浮液（1×106个/mL），将椪柑果实刺出约1 mm深的伤口来进行接种，7 d发病率便达到了100%。闫岩等[17]对汉逊德巴利酵母防治柑橘采后绿霉病的效果进行研究时，在除去砂糖橘表皮的果实最大直径部分对称刺出4 mm×4 mm的小孔，往伤口里接种20 μL的指状青霉孢子悬浮液，4 d

　　后发病率约50%，8 d后发病率约95%。罗锦等[18]探究外源硼酸对柑橘采后绿霉病的抑制效果时，用无菌接种针在柑橘果实中部刺出宽1 mm、深2 mm的伤口，往伤口里接种10 μL指状青霉孢子悬浮液（1.0×106个/mL），培养5 d后，柑橘的病斑基本覆盖整个果实表面。

　　3.4 涂抹接种

　　涂抹接种是指将病原菌的孢子悬浮液直接涂抹在柑橘果实的表面。这种接种方法与以上3种方法的不同之处在于不对果实进行人工创伤，仅通过涂抹的方式对果实接种病原菌，晾干后即可保藏培养[19]。

　　鹿连明[19]等在展开海洋放线菌A3202的发酵液对柑橘绿霉病的抑制效果的研究时，将柑橘绿霉病菌的孢子悬浮液（1×106个/mL）涂抹在果实上，接种10 d时，柑橘的病情指数为15.85，20 d时，柑橘的病情指数为50.23。

　　4 结语

　　柑橘绿霉病的病原菌是指状青霉，属柑橘潜伏性病原菌，遇到伤口时被激活，可通过细胞壁降解酶、pH值、真菌毒素等致病因子的作用对柑橘果实进行侵染。常用的人工接种柑橘绿霉病病原菌的方法有打孔法接种、划十字伤口接种、刺伤接种、涂抹接种，其中，最广泛的接种法是打孔法接种。虽然以上柑橘绿霉病病原菌的接种方法均能达到使柑橘成功患病的目的，但不同学者研究发现，柑橘品种、病原菌的接种量、贮藏温度和湿度等条件也是影响柑橘病原菌成功接种的重要因素。

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