口服酵母多糖对异育银鲫抗“鳃出血”病原感染的作用

　　本文探讨了口服酵母多糖对异育银鲫体内免疫相关物质活性与人工感染“鳃出血”病原抗病力的影响，试验结果证明酵母多糖可提高供试异育银鲫体内免疫相关物质的活性，也可增强异育银鲫抵抗“鳃出血”病原感染的能力，对鱼类的生长、体色等无不良影响。本试验由江苏省水产三新工程项目（编号：D2013-5-1）资助。

　　数十年来，利用各种抗生素类药物或者化学药物防控养殖鱼类的传染性疾病是常用的措施。但是，药物引起的病原菌耐药性和养殖水体中微生态环境失衡等问题，已经逐渐成为水产养殖业中日益严峻的问题。为了避免采用药物防治养殖鱼类的传染性疾病引起的各种问题，国内、外的研究者在利用免疫刺激剂预防养殖鱼类传染性疾病方面，也已经做了不少研究工作。目前，在国外已经有不少种类的免疫刺激剂正在水产养殖业中应用。

　　本研究利用安琪酵母股份有限公司生产的酵母多糖投喂异育银鲫（Carassius auratus gibelio）后，检测了供试异育银鲫体内免疫相关物质活性的变化与抵抗人工感染“鳃出血”病原的能力。

　　一、材料与方法

　　1、供试异育银鲫与饲养条件

　　试验在盐城裕达水产养殖场池塘中设置的网箱中进行。将来源相同、活泼无外伤的体重为（113.5±5.5）g的异育银鲫，仔细挑选规格相近的放在同一个网箱中饲养。在同一个池塘中放置的30个条件相同网箱中选择的7个网箱（分别作为Ⅰ-Ⅶ组），每个4.0m×4.0m×1.5m的网箱内饲养500尾异育银鲫，在试验期间温度变化在17.5-25.5℃之间。每天上午8：00、中午13：00和下午16：30各投喂饵料1次，投饵量以使异育银鲫达到饱足并有少量剩余为准。所用饲料为惠裕饲料科技有限公司生产的异育银鲫专用饲料。

　　2、酵母多糖

　　用于本研究的免疫增强剂是安琪酵母股份有限公司以医药专用酵母生产的福邦牌酵母多糖，该产品中含有的β-葡聚糖≥20%，α-甘露聚糖肽≥20%，肽类及蛋白质≥30%，几丁质≥2.0%。

　　3、酵母多糖投喂剂量与程序

　　根据各组试验异育银鲫的总体重，在定量的饲料中添加不同剂量的酵母多糖，制作成内含不同水平的酵母多糖的颗粒饲料后分别投喂Ⅰ-Ⅵ组试验异育银鲫，即自I号至Ⅴ号网箱的投喂免疫增强剂的剂量分别为100mg/kg.B.W、200.0mg/kg.B.W、300.0mg/kg.B.W、400.0mg/kg.B.W、500.0mg/kg.B.W和600.0mg/kg.B.W。Ⅶ号网箱的试验异育银鲫则投喂未添加酵母多糖的饲料，作为对照组。每天投喂相当于鱼体重2.5%的饲料，连续投喂28d。

　　4、采血

　　于免疫接种并投喂添加酵母多糖饲料后的第29d，从各组中分别随机捞取15尾供试异育银鲫，对其断头取血。将每尾鱼的血液分为2份，其中1份以肝素抗凝，制备抗凝血，供检测白细胞吞噬活性；将另一份血液首先在室温下静置1h待其凝固，置4℃冰箱保持4h后，于4℃条件下以4000r/min离心10min，收集上层血清，保存在4℃冰箱中，备用。

　　5、白细胞吞噬活性的测定

　　在0.2mL抗凝血中加入0.1mL福尔马林灭活的金黄色葡萄球菌，摇匀，在25℃的恒温水浴锅中孵育45min，每隔10min摇动1次。用吸管吸取血细胞涂片，每个样品涂5张，用甲醇固定10min，Giemsa染色液染1h，水洗风干后，镜检，并依下式计算白细胞吞噬百分比（phagocytic percentage，PP）和吞噬指数（phagocytic index，PI）。

　　吞噬百分比（PP）=（100个吞噬细胞中参与吞噬的细胞数/100）×100

　　吞噬指数（PI）=细胞内总菌数/参与吞噬的细胞数

　　6、溶菌酶活性的测定

　　用0.067mol/L的磷酸缓冲液（PBS，pH6.4）将溶壁微球菌（Micrococcus lysoleikticus）配制成0.2mg/mL的菌悬液。每个样品取3.0mL菌悬液，吸取血清0.04mL加入到菌悬液中，混匀后，立刻在540nm下测定A。值。然后在28℃水浴中温育30min，取出后置于4℃冰浴终止反应，再测定A值。计算溶菌酶活性单位：U=（A。-A）/A。

　　7、血清中谷丙转氨酶活性的测定

　　采用谷丙转氨酶试剂盒（上海科欣生物技术研究所产品，批号：20140706）测定。

　　8、血清中总蛋白含量的测定

　　采用血清总蛋白试剂盒（上海科欣生物技术研究所产品，批号：20140711）测定。

　　9、攻毒

　　从试验和对照组网箱中随机各捞取50尾供试异育银鲫，放养在盛水2.0M3的圆形塑料水族箱中充气饲养。在每个水族箱中放置5尾体重300.0g左右的具有“鳃出血”典型症状的病鱼，与50尾供试鱼同居饲养2d后将其捞出，将供试鱼继续饲养观察21d。对在此期间死亡的异育银鲫进行解剖观察，判断是否由于感染“鳃出血”疾病而致死，统计各组的死亡率，依下式计算相对免疫保护率（Relative percent survival，RPS）。

　　免疫保护率（RPS）=[1-（免疫组死亡率/对照组死亡率）]×100

　　二、结果

　　1、溶菌酶活性和白细胞吞噬活性的变化

　　投喂添加酵母多糖的饲料后，对照和试验组异育银鲫的血清溶菌酶活性和白细胞吞噬活性的测定结果如表1所示。投喂酵母多糖的试验组异育银鲫的血清溶菌酶活性显著高于对照组（t测验，P<0.05）。白细胞吞噬活性的测定结果表明，试验鱼体白细胞的PP和PI均极显著地高于对照组（t测验，P<0.01）。

　　2、血清总蛋白和SGPT活性的变化

　　供试异育银鲫的血清中总蛋白含量和SGPT活性测定结果如表2所示。添加免疫多糖的试验组鱼体的血清中总蛋白含量有所提高，但是，对照与试验组异育银鲫血清中蛋白含量并未出现显著性差别（t测验，P>0.05）。对SGPT活性的测定结果表明，在饲料中添加酵母多糖可以降低鱼体血清中SGPT的活性，但是，试验与对照组异育银鲫之间也并未出现显著性差异（t测验，P>0.05）。

　　3、攻毒后的存活率

　　对照及试验鱼在与典型病鱼同居感染攻毒后，各组的死亡情况如表3所示。从表3可以看出，经过投喂酵母多糖的异育银鲫均获得了一定的RPS，而在饲料中添加酵母多糖的试验组异育银鲫死亡率明显的低于未添加酵母多糖的对照组，与对照组相比，当酵母多糖酵在饲料中的添加量为500.0mg/kg.B.W.时，受免异育银鲫的获得了最高的RPS，但是，各个添加酵母多糖的试验组之间的RPS则未出现显著性差别（t测验，P>0.05）。

　　三、讨论

　　关于异育银鲫的“鳃出血”病，研究者们已经用不同的方法证明了其病原是病毒。而对于鱼类的病毒性疾病，目前尚无有效的药物可以治疗。本试验结果证明了酵母多糖对这种病毒病是具有预防作用的。本研究结果不仅证明了酵母多糖对供试异育银鲫的几种免疫相关物质的活性具有刺激作用，而且采用将供试鱼与典型病鱼同居感染的方式，证明了供试鱼是具有提高试验鱼抵抗病原感染的作用的。6个不同剂量对供试异育银鲫血清中几种免疫相关物质活性的差别均不是很明显，说明在异育银鲫的饵料中酵母多糖的添加量以100.0-600.0mg/kg.B.W.均具有一定的作用。

　　至于添加有酵母多糖饵料的投喂时间究竟以连续多长时间为宜，以及在饲料中酵母多糖的最适宜添加量等，尚需要进一步研究。

　　文/华中农业大学 陈昌福 胡明

　　江苏省渔业技术推广中心 方苹 陈辉 刘训猛 袁锐