site-3 毒素对心肌细胞钠通道的电生理效应与作用机制

　　【摘要】site-3毒素是从海葵和蝎子等生物中提取出来的多肽类毒素，能够与电压门控钠通道IV区域的S4段附近site-3位点结合，从而抑制钠通道的快速失活。本文综述了site-3毒素作用于心肌细胞钠通道的电生理效应及与心肌细胞钠通道相互作用的分子机制。

　　【关键词】钠通道；site-3毒素；电生理效应；分子机制

　　site-3 毒素是一系列能够特异性结合心肌细胞电压门控钠通道，并对其电流变化产生影响的多肽类毒素，包括从黄海葵（Anthopleura xanthogrammica） 分离提取的Ap-A、Ap-B， 从横沟海葵（Anemoniasulcata） 分离提取的ATXI、ATXII、ATXIII以及从蝎子(Leiurus quinquestriatu) 中提取的α- 蝎毒素。这类毒素可以特异性结合于钠通道位于细胞外表面的IV 区域S4 段附近的部位3，即site-3 位点，从而抑制钠通道失活，产生相应的电生理变化，因此被命名为site-3毒素。该类毒素与钠通道的结合过程具有电压依赖性，即与钠通道的亲和力随着细胞膜的去极化而降低，在帮助人们理解钠离子门控通道的结构方面曾起到重要作用[1]。

　　1 site-3 毒素的结构特点

　　site-3 毒素包括海葵毒素和蝎毒，其中海葵毒素分为I 型和II 型毒素，I 型是从海葵属Anthopleura 与Anemonia 中分离出来的，包括ATXI、ATXII、ATXIV 和AP-A、B 等；

　　II 型是从海葵属Heteractis 与Stichodactyla 分离出的RTXI-V、RPI-IV( 包括ATXIII、PaTX等)，其中报道最多、研究最广泛的是ATXII和AP-A。海葵毒素中提取的ATXII，是由47个氨基酸残基组成的T 型长肽，分子量4 770kDa，能与心肌细胞外表面的钠通道3 位点结合，抑制其失活。AP-A 在溶液中呈三维结构：4 条短的反向平行的β 片层通过3 个环紧密连接起来，第一个环始于I 型β 折角，包括2 个重要的Asp 残基；第二个环由二硫键形成的2 个完整的β 折角构成；第三个环包含有Gly40-Pro41 残基[2-3]。有实验表明，用甘氨酸取代Ap-B 的10 位或15 位氨基酸残基后，能够显著降低其亲和性，而取代16 位的天冬酰胺或19 位的丝氨酸（均为疏水性氨基酸）则对其亲和性影响较小，但是在上述两位点进行带电氨基酸的引入能大大降低毒素修饰通道的能力。此外，18 位亮氨酸的大小、形状和疏水性对于该毒素的作用也很重要，如果该位点被缬氨酸代替其亲和性将降低100倍[4-5]。

　　从北非蝎子（Leiurus quinquestriatus）提取的α- 蝎毒素和从美洲蝎子(Centruroidessculpturatus ) 提取的β- 蝎毒素， 都是由60~70 个氨基酸残基组成的碱性多肽，分子量7 000 kDa 左右，有4 对二硫键。两类蝎毒素的氨基酸序列有显著同源性，其中α- 蝎毒素能够特异性地与通道受体部位3 结合，这与海葵毒素的作用位点是一致的，而β- 蝎毒素则能特异性地结合于通道受体部位4 [6]。

　　2 site-3 毒素特异性结合的电压门控钠通道的结构特点

　　电压门控钠离子通道（Nav）即通过电压调节的钠通道，迄今发现，Nav 成员中氨基酸序列同源性远远高于50%，因此将它们统一归于Nav 1 超家族。该家族共有9 种类型钠通道，分别为Nav 1.1~ Nav 1.9，其中Nav1.1、Nav 1.2、Nav 1.3、Nav 1.7 由基因3P23-24 编码，Nav 1.5、Nav 1.8 和Nav 1.9 则由基因3P21-24 编码，而Nav 1.4 和Nav 1.6 分别由3q23-24 和12q13b 编码。

　　上述电压门控钠通道中，site-3 毒素作用的心肌细胞钠通道属于Nav 1.5，该通道由共含2016 个氨基酸残基的4 个同源结构域（DI-DIV）组成的跨膜蛋白构成，每个同源结构域包含6 个片段（S1-S6）。Nav 1.5 由5 种亚单位构成，即α，β1-β4 亚基，其中α 亚基能够单独传导通过心肌细胞的钠离子流，在心肌细胞去极化过程中起决定性作用，而β1-β4 亚基在调节通道的离子流方面起辅助作用。电压传感结构负责通道中每一个结构域的S4 段（富含赖氨酸）的开放，在快速失活中通道的开放区域是DIII 和DIV，通道C 端则在缓慢失活中发挥作用[7]。

　　3 site-3 毒素对心肌细胞钠通道的电生理效应

　　心肌细胞去极化过程中，门控电流的强度因不同的钠通道亚型而异。由后超极化缓慢到达去极化的过程当中，存在方向向外的离子流，源于DIII 和DIV 的S4 段的电荷变化。site-3 毒素作用于心肌细胞的基础是抑制DIV 的S4 段向外运动，所有site-3 毒素作用于心肌钠通道的实验均表明，DIV 的S4 段在耦合钠通道的激活和失活时起到独特的作用。尽管DIV 的S4 段活动要比其他3 个S4 段慢，但它的移位所导致钠通道的快速失活却是相当迅速的（百微秒级）[8]。

　　研究表明，site-3 毒素能够促进心肌细胞处于失活状态的钠通道恢复活性，且在较负的电压下毒素修饰的钠通道从失活状态到稳定状态的速度较正常时快。研究ATX II 对心肌钠通道修饰作用时发现，随着测试电压绝对值变小，其平均开放时间自动延长。不同种类site-3 毒素均可延长钠通道的开放时间，而且对于心肌细胞钠通道的作用要大于神经细胞钠通道。

　　被site-3 毒素修饰过的钠通道其去修饰化过程非常慢，且具有状态独立性，很大程度上取决于毒素与不同钠通道亚型之间亲和性的差异；而所有site-3 毒素去修饰化过程在不同的电位情况下却是相似的。Ap-B 和心肌细胞钠通道作用后，从关闭状态到静息状态速率低达0.0001 s-1，这说明在毒素作用很长时间后仍有相当一部分毒素保持着与通道结合的状态，从而延长钠通道的开放时间。有研究表明，当钠通道处于关闭状态时，毒素与DIV 的S3 和S4 接头相连接，此时具有最高的亲和性；而当钠通道处于失活状态时毒素与钠通道具有最低的亲和性，说明S3 和S4 接头部位处于细胞外表面[9]。

　　4 site-3 毒素引起心肌细胞钠通道门控电流变化的分子机制

　　4.1 site-3 毒素引起门控电流变化的结构基础与离子通道开放相关的膜内电荷的运动

　　所引起的电流变化称为门控电流。site-3 毒素引起的心肌细胞门控电流的变化是由于α 亚基的4 个区域的S4 段所形成的电压感受器的移动引起的[10]。早期研究发现ATX-II 能够降低最大门控电流且缩短门控电流在去极化期间衰减的时间。后来研究发现，Ap-A 毒素能且只能对钠通道从开放状态到失活状态所产生的门控电流起抑制作用，并使其最大门控电流减小33%。这说明在去极化期间Ap-A修饰的钠通道门控电流的减少是发生在钠通道从开放状态到失活状态过程中的，该过程呈明显的电压依赖性。并且在钠通道开放之前仅有三分之二的钠通道趋向于开放[11-12]。

　　在心肌细胞钠通道的S4-DIV段最外面的3 个精氨酸残基被逐步中性化为丝氨酸残基的过程中，测量site-3 毒素所引起的钠通道门控电流的变化，发现由site-3 毒素引起的门控电流的减少是由于S4-DIV 段的抑制所导致的，最外面3 个残基的作用效应不同，且最外面的残基可以决定由S4-DIV 段所引起的三分之二的电流减少量[13]。

　　部分site-3 毒素（如AP-B 等）同样作用于人类骨骼肌细胞钠通道的门控电流，骨骼肌钠通道的动力学效应要比心肌细胞钠通道快，而且骨骼肌细胞钠通道的最大电荷量要比心肌细胞钠通道的大。site-3 毒素能够抑制S4-DIV 段的活动，这种抑制是由于在其失活位置稳定了电压感受器，同时使得S4-DIV 段随着电压的轻微的变正而产生电压依赖性运动[14]。

　　4.2 site-3 毒素对心肌细胞钠通道电压感受器的作用

　　在对site-3 毒素修饰的心肌细胞钠通道进行测量时，发现了一种由site-3 毒素α- 亚基的4 个区域中各个S4 段共同形成的电压感受器，该电压感受器可引起门控电流微小的变化。分析目前已知的电压门控钾通道晶体结构，其激活态的门控通道是由4 个M2 的α 环组成的束状细胞内结构形成[15]。在去极化期间，所有的4 个S4 段的活动都体现在S6 区段细胞内的末端移开覆盖的孔道，该孔道由S6 段α 环的甘氨酸残基形成 [16]。人们发现电压门控钠通道的开放发生在前3 个区域的S4 段和S4-DIV 段不同程度移动以后，而且S6-DIV段与其它3 个区域的S6 段不同，因为它包含一个丝氨酸残基（该氨基酸很可能是人们所推断的转折点），而其它3 个区域的S6 段都有典型的甘氨酸残基。在电压门控钾通道中，S4 的活动牵拉S4 和 S5 的连接部位，这使得S6 段在甘氨酸这个转折点上弯曲，进而引起通道的开放，这说明S4-DIV 在耦合激活到快速失活中的独特作用可能是依靠DIV 的S6 段转折处的丝氨酸残基[17]。

　　此外，人体心肌细胞钠通道(hH1a) DIV的S3 和 S4 段之间的1617 位苯丙氨酸残基的缺失与3 型的长QT 综合征有关，用Ap-A毒素抑制S4-DIV 的移动以后，发现由缺失1617 位苯丙氨酸残基的S4-DIV 段引起的门控电流与野生型钠通道的门控电流相比减少了37%[18-20]。

　　5 结语

　　总之，site-3 毒素特异性作用于心肌细胞电压依赖性门控钠通道的DIV 段电压感受器，影响了该通道从开放状态到失活状态的过程。这对于研究钠通道的结构和动力学过程有很大的辅助作用，也可以用来分析研究某些局麻药的作用机制，从而避免或减轻临床应用局麻药所引起的心律异常。同时，根据其分子作用机制的特点，可以通过联合用药来减少局麻药对机体的不利影响，并为新药开发、药理研究等提供指导。

　　参考文献

　　[1] Catterall WA， Cestele S， Yarov-Yarovoy V，etal. Voltage-gated ion channels and gatingmodifier toxins. Toxicon [J]，2007， 49(2)：124-141.

　　[2]Moran Y， Gordon D， Gurevitz M. Seaanemone toxins affecting voltagegatedsodium channels--molecular andevolutionary features. Toxicon. 2009 Dec15；54(8)：1089-101.

　　[3] Salceda E， López O， Zaharenko AJ， etal. Thesea anemone Bunodosoma caissarum toxinBcIII modulates the sodium current kinetics ofrat dorsal root ganglia neurons and is displacedin a voltage-dependent manner. Peptides.2010 Mar；31(3)：412-8.

　　[4]Seibert AL， Liu J， Hanck DA， etal. Arg-14 loop of site 3 anemone toxins： effectsof glycine replacement on toxin affinity.Biochemistry[J]， 2003， 42：14515-14521.

　　[5] Seibert AL， Liu J， Hanck DA， etal. Roleof Asn-16 and Ser-19 in anthopleurin Bbinding. Implications for the electrostaticnature of Na(V) site. Biochemistry[J]， 2004，43(22)： 7082-7089.

　　[6] Moran Y， Kahn R， Cohen L， etal. Molecularanalysis of the sea anemone toxin Av3 revealsselectivity to insects and demonstrates theheterogeneity of receptor site-3 on voltagegatedNa+ channels. Biochem[J]， 2007，406(1)： 41-48.

　　[7]Hanck DA， Sheets MF. Site-3 toxins andcardiac sodium channels. Toxicon. 2007Feb；49(2)：181-93.

　　[8] Song Y， Shryock JC， Belardinelli L. Anincrease of late sodium current inducesdelayed afterdepolarizations and sustainedtriggered activity in atrial myocytes. Am JPhysio Heart Circ Physiol [J]， 2008， 294(5)：H2031-2039.

　　[9]Zaharenko AJ， Schiavon E， Ferreira WAJr， etal. Characterization of selectivity andpharmacophores of type 1 sea anemone toxinsby screening seven Na(v) sodium channelisoforms. Peptides. 2012 Mar；34(1)：158-67.

　　[10] He H， Liu Z， Dong B， Zhou J， etal.Molecular determination of selectivity of thesite 3 modulator (BmK I) to sodium channelsin the CNS： a clue to the importanceof Nav1.6 in BmK I-induced neuronalhyperexcitability. Biochem J. 2010 Oct15；431(2)：289-98.

　　[11] Smith JJ， Blumenthal KM. Site-3 seaanemone toxins： Molecular probes of gatingmechanisms in voltage-dependent sodiumchannels. Toxicon [J] 2007， 49： 159-170.

　　[12] Gurevitz M. Mapping of scorpion toxinreceptor sites at voltage-gated sodiumchannels. Toxicon. 2012 Sep 15；60(4)：502-11.

　　[13] Campos F， Chanda B， Beirao P， etal.Electrophysiological and site-specificfluorescence measurements on alpha-scorpiontoxin bound voltage-gated sodium channels.Biophys[J]， 2006，382-93.

　　[14] Bant JS， Aman TK， Raman IM. Antagonismof lidocaine inhibition by open-channelblockers that generate resurgent Na current. JNeurosci. 2013 Mar 13；33(11)：4976-87.

　　[15] Liu P， Jo S， Bean BP. Modulation ofneuronal sodium channels by the sea anemonepeptide BDS-I. J Neurophysiol. 2012Jun；107(11)：3155-67.

　　[16] Long SB， Campbell EB， Mackinnon R.Voltage sensor of Kv1.2： structural basisof electromechanical coupling. Science[J]，2005，309：903-908.

　　[17] Lipkind GM， Fozzard HA. Molecularmodeling of local anesthetic drug bindingby voltage-gated sodium channels. MolPharmacol[J]， 2005，68：1611-1622.

　　[18]Chen T， Inoue M， Sheets M. Reducedvoltage dependence of inactivation in theSCN5A sodium channel mutation delF1617.Am J Physiol Heart Circ Physiol[J]， 2005，288(6)： 66-76.

　　[19] Gur M， Kahn R， Karbat I， etal. Elucidationof the molecular basis of selective recognitionuncovers the interaction site for the coredomain of scorpion alpha-toxins onsodium channels. J Biol Chem. 2011 Oct7；286(40)：35209-17.

　　[20] Campos FV， Chanda B， Beir-o PS，etal. Alpha-scorpion toxin impairs aconformational change that leads to fastinactivation of muscle sodium channels. JGen Physiol. 2008 Aug；132(2)：251-63.

　　作者简介

　　金茜玫，女，第二军医大学2009 级在读本科生；王杨凯，男，第二军医大学基础部生理学教研室讲师，研究方向：心血管生理。

　　金茜玫1　王杨凯2　第二军医大学基础部生理学教研室　上海市　200433

关注读览天下微信， 100万篇深度好文， 等你来看……